Молекулярно-биологические подходы в диагностике и лечении рака молочной железы (Коваленко С.П.)

Первопричина онкологических заболеваний - нарушения в регуляции клеточного деления, следствие таких нарушений - неконтролируемый рост клеток, формирование злокачественных новообразований. Изменения в концентрации или структуре целого ряда белковых молекул-регуляторов приводят к неконтролируемому росту клеток, как правило в основе таких изменений лежат нарушения исходной генетической информации соматических клеток - соматические мутации. Контроль за возникновением мутаций, за появлением измененных белков в клетке - задачи вполне решаемые современной молекулярной биологией.

Успехи молекулярной биологии в последние четверть века позволяли надеяться на появление новых, эффективных методов профилактики, диагностики и лечния онкологических заболеваний. Такие методы начали появляться совсем недавно - в течение последних 5-7 лет.

Настоящая публикация посвящена  новым молекулярно-биологическим технологиям в профилактике, диагностике и лечении рака молочной железы - наиболее частому онкологическому заболеванию у женщин

Совершенно новый подход к профилактике рака молочной железы начал формироваться в конце 90-годов XX века, с выявлением генов человека, нарушения в которых являются основной причиной формирования семейных форм рака молочной железы (1). Семейные формы рака молочной железы составляют 5-15% от всех случаев заболевания (2), однако в отличие от спонтанных форм рака молочной железы уверенный прогноз заболевания у женщин из отягощенных семей может быть сделан задолго до возникновения заболевания. Носители мутаций в генах BRCA1/2 заболевают раком в 80-90% случаев (3), анализ мутаций может быть проведён в любом возрасте (начиная с раннего детского), заболевания возникают не ранее времени полового созревания (как правило - значительно позже). Таким образом, появилась возможность выявлять в генетически отягощенных семьях лиц, у которых с очень высокой вероятностью в течение жизни возникнет злокачественное новообразование. Такая возможность создала принципиально новую ситуацию для профилактики онкозаболеваний -  необходимость выделять группы с очень высоким риском заболевания, проводить для этой группы более частые и как можно более тщательные медицинские осмотры, возможно, выработать какие-то специфические рекомендации по образу жизни и приёму медикаментов. Следует заметить, что анализ мутаций в генах, обуславливающих наследственную предрасположенность к раку молочной железы (в основном - гены BRCA1/2), процедура хотя и вполне реальная, но пока что достаточно трудоёмкая и дорогостоящая, требующая работы высококвалифицированного персонала. При анализе мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 исследователь на первом этапе анализирует наличие 4-5 наиболее часто встречающихся мутаций, если эти мутации не обнаружены, то для достоверного ответа необходимо устанавливать полную нуклеотидную последовательность кодирующей части генов. Такая задача под силу только достаточно хорошо оборудованной лаборатории, в которой работают высококвалифицированные кадры. В то же время, разрабатываются более простые и технологичные методы, что позволяет надеяться на внедрение методов анализа в практику в ближайшем будущем. Есть и еще один аспект проблемы - выявление семейных форм рака молочной железы. К сожалению, в течение долгих лет, наследственная компонента в возникновении онкозаболеваний практически не принималась во внимание в большинстве онкологических диспансеров, данные о семейном группировании онкозаболеваний крайне ограничены. Безусловно, первое, что необходимо сделать для внедрения принципиально новых знаний о природе наследственных онкозаболеваний в медицинскую практику - провести кропотливую работу по выявлению семей, в которых группируются случаи онкозаболеваний.

В вопросах диагностики специфических форм рака молочной железы совсем недавно начало выделяться совершенно новое направление, позволяющее дифференцировать гистологически однородные формы опухолей по степени экспрессии рецепторов эпидермальных факторов роста (4). Суть в том, что на поверхности клеток целого ряда злокачественных опухолей резко увеличивается количество рецепторов эпидермального фактора роста (EGF) и 3 типов рецепторов того же семейства (HER-2,3 и 4). Эти рецепторы имеют аналогичную "блочную" структуру и каждый представляет собой композицию из 3 доменов - домен, находящийся на поверхности клетки и связывающийся с лигандом, трансмембранный липофильный сегмент и внутриклеточный домен, обладающий тирозинкиназной активностью (5). При связывании лиганда (в норме лигандом служит эпидермальный фактор роста) с одним из рецепторов, рецепторы начинают формировать гомо- или гетеродимеры, что приводит к активации  внутриклеточной протеинкиназной активности этих рецепторов. В результате фосфорилируются внутриклеточные белки, вовлеченные в инициацию клеточной пролиферации (6). Результат этого процесса - активация деления клетки. В норме деление клеток достаточно жестко контролируется количеством фактора роста, связывающегося с рецептором. При увеличении количества рецепторов на поверхности клетки гетеро- и гомодимеры возникают самопроизвольно (без связывания с лигандом), что приводит к постоянной активации деления клетки и, как следствие, к злокачественному росту. Это лишь один из механизмов возникновения злокачественного роста, однако именно опухоли с избыточным количеством рецепторов на поверхности клеток обладают наиболее агрессивным фенотипом,  развитие болезни при возникновении таких опухолей имеет достаточно плохие прогнозы, выживаемость пациентов значительно ниже средних показателей для данной патологии в целом. Примерно в 25-30% случаев злокачественных новообразований молочной железы опухоли содержат повышенное количество рецепторов на поверхности клеток. Медикаментозное лечение злокачественных опухолей, обусловленных повышенной экспрессией EGF рецепторов и HER2, должно проводиться по специфической схеме. Так, тамоксифен, по всей видимости, приводит к негативным эффектам лечения таких опухолей, тогда как гормональное лечение даёт хорошие результаты (7). Опухоли с гиперэкспрессией HER2  устойчивы к циклофосфамидам и метатрексату, в то же время хемотерапия на основе антрациклина даёт хорошие результаты (8). Таким образом, прогноз развития опухоли и выбор эффективной схемы лечения тесно связаны с характером экспрессии рецепторов на поверхности клеток опухоли.

В настоящее время используют два основных подхода к анализу экспрессии рецепторов на поверхности опухолевых клеток - иммунноферментный анализ и FISH (fluorescent in-situ hybridization)-анализ (9). В первом случае используют специфические к рецепторам антитела, с их помощью непосредственно оценивают количество рецепторов на клетке. Во втором случае проводят анализ копийности гена,  поскольку известно, что именно увеличение дозы гена приводит к повышенной экспрессии рецепторов. Как правило, эти подходы дают хорошо согласующиеся результаты. Совсем недавно для анализа экспрессии рецепторов в опухолевых клетках стали использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в количественном варианте, с использованием техники ПЦР в реальном времени (real time PCR).

Наиболее впечатляющие результаты за последние несколько лет получены молекулярными биологами в разработке нового препарата, позволяющего эффективно лечить злокачественные опухоли молочной железы, обусловленные повышенной экспрессией рецепторов  эпидермального фактора роста. В течение нескольких лет группа учёных из ведущей биотехнологической американской фирмы Genentech разработала новый препарат Trastuzumab (другое название - Herceptin), позволяющий блокировать димеризацию рецепторов даже при их повышенной экспрессии (10). Идея создания препарата возникла в результате исследований, показавших, что антитела к HER2 рецепторам при добавлении их к растущим клеткам препятствуют формированию димеров рецепторов и блокируют клеточную пролиферацию даже в случае гиперэкспрессии рецепторов на поверхности клеток. Изначальные попытки применять антитела в терапевтических целях были безуспешны из-за сильного иммунного ответа пациента на чужеродные антитела. В связи с этим была поставлена задача "гуманизировать" антитела, т.е. с помощью генно-инженерных манипуляций создать такие антитела, которые не будут распознаваться иммунной системой человека как чужеродные. Были получены мышинные моноклональные антитела против рецепторов эпидермального фактора роста человека, мРНК гибридомных клеток, экспрессирующих соответвтующие моноклональные антитела была переведена в кДНК, кДНК клонирована в плазмидных векторах, клоны, содержащие кДНК, кодирующие моноклональные антитела отобраны,  эти кДНК объединены с фрагментами генов человека, кодирующими константные части иммунноглобулинов. В результате был получен искусственно созданый химерный ген, кодирующий вариабельные части иммуноглобулина мыши, связывающегося с HER2 рецепторами, и константные части иммуноглобулина человека. Полученный ген экспрессировали в культуре эукариотических клеток, химерный иммуноглобулин исследовали на возможность использовать в терапевтических целях. Иммунный ответ на введённый химерный белок был значительно снижен по сравнению с исходным мышинным моноклональным антителом, но всё же оставался достаточно высоким. В таком виде его применение в качестве лекарственного препарата было невозможным. Кропотливая работа по замене шаг за шагом целого ряда аминокислот в молекуле химерного антитела всякий раз с проверкой иммунногенности получавшихся вариантов белка, в конце концов, привела к созданию искусственных антител, эффективно связывающих рецепторы HER2, но не вызывающих иммунного ответа при ввдении в организм человека. На основе таких искусственно сконструированных иммунноглобулинов и был создан препарат Trastuzumab (Herceptin). На сегодняшний день этот препарат, по-видимому, являтся самым эффективным средством медикаментозной терапии HER2-позитивных опухолей молочной железы. Следует отметить, что наряду с препаратом на основе генно-инженерно сконструированных антител к рецепторам HER2, достаточно эффективны препараты и другого типа - специфические ингибиторы тирозинкиназной активности EGF рецептора (ZD1839, Iressa). Эффективность действия Trastuzumab повышается при его комбинированном применении как с ZD1893, так и с другими, более традиционными химиотерапевтическими препаратами (5).

Таким образом, развитие молекулярно-биологических технологий в течение последних 5-7 лет создало принципиально новые возможности для профилактики рака молочной железы, позволив выделять группы людей с очень высокой наследственной предрасположенностью к возникновению рака молочной железы, позволило выделять группы онкологических больных, прогноз развития болезни и эффективная медикаментозная терапия для которых специфичны, наконец, на основе разработанных технологий было создано принципиально новое и высокоэффективное лекарственное средство.

Список литературы

1. L.W. Ellisen and D.A. Haber (1998), Herediatary Breast Cancer, Annual Review of Medicine, v.49, pp.425-36

2. S. Henahan (1997), Predicting Breast Cancer Risk, JAMA

3. Bishop DT, 1999, BRCA1 and BRCA2 and breast cancer incidence: a review, Annual Review of Oncology, v.10 Suppl 6:pp.113-119

4. Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N. (1995), Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol,v.19, pp. 183-232

5. Baselga J. (2002), Combined anti-EGF receptor and anti-HER2 receptor therapy in breast cancer: a promising strategy ready for clinical testing, Annals of Oncology, v. 13, pp.8-9

6. Yarden Y, Sliwkowski MX (2001) . Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; v. 2, pp. 127-137

7. Spigel DR, Burstein HJ. (2002), HER2 Overexpressing Metastatic Breast Cancer, Curr Treat Options Oncol., v.3(2), pp.163-174

8. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S et al. (2001),  Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med, v.344, pp. 783-792.

9. McCormick SR, Lillemoe TJ, Beneke J, Schrauth J, Reinartz J.(2002), HER2 assessment by immunohistochemical analysis and fluorescence in situ hybridization: comparison of HercepTest and PathVysion commercial assays. Am J Clin Pathol, v.117(6),pp.935-43

10. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D et al (1999),. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic breast disease. J Clin Oncol; 17: 2639-2648