Real-time-PCR-5382insC

Назначение набора

Набор реактивов Real-Time-PCR-5382insC предназначен для выявления наиболее распротраненной в России мутации, обуславливающей наследственную форму рака молочной железы или рака яичников. Набор позволяет выявить мутацию BRCA1 5382insC в геномной ДНК человека с использованием ПЦР в режиме реального времени. Набор оптимизирован для проведения анализа с использованием прибора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), а также совместим с большинством приборов для ПЦР в режиме реального времени.

Характеристики набора

Набор содержит достаточное количество реагентов для проведения 25 анализов. Исходным материалом для проведения анализа должна быть геномная ДНК. Рекомендуемое количество ДНК для проведения одного анализа составляет 10 - 100 нг. При выделении ДНК рекомендуем использовать набор для выделения ДНК из цельной крови. При использовании других технологий выделения ДНК рекомендуем работать с количествами ДНК, по крайней мере, в 4 раза превышающими минимально возможные. Минимальное количество ДНК, необходимое для анализа – 2 нг. Максимальное количество ДНК, которое может быть использовано для 1 анализа – 1000 нг.

Материал для исследования

Цельная кровь с ЭДТА (не применять гепаринизированную кровь!). Кровь можно заморозить и хранить при -20°С до момента выделения ДНК из пробы.

Принцип действия набора

Анализ проводится с использованием аллель-специфической ПЦР. Для выполнения анализа необходимо провести 2 реакции:
ПЦР с использованием праймеров, нуклеотидная последовательность которых комплементарна последовательности фрагмента гена BRCA1 без мутации 5382insC (wt) ;
ПЦР с использованием праймеров, нуклеотидная последовательность которых комплементарна последовательности фрагмента гена BRCA1 с мутацией 5382insC (mut).
Для проверки корректности работы набора во всех случаях необходимо в той же серии экспериментов проводить ПЦР с использованием в качестве матрицы:
А) геномной ДНК человека, не содержащей мутации 5382 insC (отрицательный контроль 1);
Б) геномной ДНК человека, не содержащей мутации 5382 insC в смеси с плазмидой, содержащей фрагмент ДНК гена BRCA1 с мутацией 5382insC (положительный контроль);
В) дистиллированную воду (отрицательный контроль 2).

Использование для ПЦР смеси, содержащей wt праймер, должно приводить к эффективной специфической ПЦР при наличии геномной ДНК человека (отрицательный контроль 1, положительный контроль и все исследуемые образцы). Кривая амплификации должна появляться не позднее 35 цикла. Использование для ПЦР смеси, содержащей mut праймер, должно приводить к эффективной ПЦР при наличии геномной ДНК человека, содержащей мутацию (положительный контроль и исследуемые образцы, содержащие мутацию). Кривая амплификации должна появляться не позднее 35 цикла. В то же время при внесении в реакционную смесь большого количества исследуемой ДНК возможно появление неспецифической кривой ПЦР, но не ранее, чем через 7 циклов после появления кривой специфической ПЦР для данного образца с использованием wt праймера.

Состав набора

• смесь олигонуклеотидов, содержащая праймер wt (5382-W);
• смесь олигонуклеотидов, содержащая праймер mut (5382-M);
• смесь реагентов (5382-Com);
• геномная ДНК человека без мутации 5382insC в гене BRCA1 (отрицательный контроль 1);
• смесь, содержащая геномную ДНК человека без мутации 5382insC в гене BRCA1 и плазмиду с фрагментом гена BRCA1 с мутацией 5382insC (положительный контроль);
• деионизованная вода;
• инструкция по применению набора.

Условия хранения

Набор должен храниться в темноте при температуре -20°С.