Real-time-PCR-EGFR-Leu858Arg

Назначение набора

Набор реактивов Real-time-PCR-EGFR-Leu858Arg предназначен для выявления мутации Leu858Arg гена EGFR, которая коррелирует с чувствительностью немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) к препаратам Иресса и Тарцева. Анализ проводится методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием SybrGreen. Набор оптимизирован для проведения анализа с использованием прибора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), а также совместим с большинством приборов для ПЦР в режиме реального времени. Набор предназначен для исследовательского применения.

Характеристики набора

Набор реактивов достаточен для анализа 4-х образцов ДНК (Кат. № 20501) или 12-и образцов ДНК (Кат. № 20501), 1 положительного стандарта и 1 отрицательного контроля, если каждый образец анализировать дважды. Рекомендуемое количество ДНК для проведения ПЦР составляет 3-5 нг. При выделении ДНК рекомендуем использовать набор для выделения ДНК из срезов тканей, залитых в парафиновые блоки. При использовании других технологий выделения ДНК рекомендуем работать с количествами ДНК, по крайней мере, в 4 раза превышающими минимально возможные. Детектируется наличие 5% мутантной ДНК EGFR на фоне ДНК дикого типа (без мутаций), что значительно превышает чувствительность прямого секвенирования.

Материал для исследования

В качестве материала для анализа может использоваться ДНК опухолей, выделенная из свежей и cвежезамороженной ткани или образцов фиксированной ткани, заключенной в парафин. Опухолевая ткань, из которой выделяется ДНК для анализа, должна содержать не менее 10% опухолевых клеток.

Принцип действия набора

Участок гена EGFR с мутацией амплифицируется методом ПЦР с помощью аллельспецифичных праймеров. Амплифиция ДНК детектируется методом ПЦР в реальном времени по усилению флуоресценции красителя SybrGreen. Количество циклов ПЦР, необходимых для того, чтобы флуоресценция превысила уровень фона, называется Ct. ДНК EGFR дикого типа (без мутаций) амплифицируется в тех же условиях с увеличением Ct на 7-10 циклов, что позволяет отличать ее от мутантной. Величина Ct зависит также от количества и качества ДНК, вносимой в ПЦР. Для нормировки теста проводится контрольная ПЦР с праймерами на константный район гена EGFR. Таким образом, с каждым препаратом ДНК проводится 2 реакции на EGFR: одна контрольная реакция и одна реакция, соответствующая мутации Leu858Arg. Результаты анализа представляются в виде разницы ΔCt = Ctмут - Ctконтр. Для корректности результата все образцы тестируются как минимум дважды.

Для контроля специфичности и чувствительности теста в набор входит положительный стандарт, содержащий 5% мутантной ДНК EGFR. Положительный стандарт тестируется параллельно с неизвестными образцами. Образец является положительным (содержащим мутацию), если ΔCt образца равно или меньше ΔCt положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 5%), если ΔCt образца больше ΔCt стандарта.

Состав набора

• ПЦР смесь без полимеразы для детекции EGFR с мутацией Leu858Arg;
• контрольная ПЦР смесь без полимеразы для детекции константного участка EGFR без мутаций;
• Taq ДНК полимераза;
• положительный стандарт содержащий 5% мутантной ДНК EGFR-Leu858Arg;
• контрольная ДНК человека без мутаций в гене EGFR;
• вода для ПЦР;
• инструкция по применению

Набор не содержит реактивов для выделения ДНК.

Условия хранения

Хранить в темноте при -20°С в течение 6 месяцев.