Real-time-PCR-KRAS-7M

Назначение набора

Набор KRAS-7М выявляет с помощью аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (АС-рвПЦР) семь наиболее часто встречающихся мутаций в гене KRAS человека. Эти мутации коррелируют с устойчивостью к анти-EGFR терапии.

1. Gly12Cys (GGT>TGT)
2. Gly12Ser (GGT>AGT)
3. Gly12Arg (GGT>CGT)
4. Gly12Val (GGT>GTT)
5. Gly12Asp (GGT>GAT)
6. Gly12Ala (GGT>GCT)
7. Gly13Asp (GGC>GAC)

Набор предназначен только для исследовательского применения и оптимизирован для проведения анализа с использованием прибора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), а также совместим с большинством приборов для ПЦР в режиме реального времени.

Характеристики набора

Набор содержит достаточное количество реактивов для проведения 4 анализов (Кат. № 20401 или 10 анализов ДНК (Кат.№ 20402), 1 положительного стандарта и 1 отрицательного контроля. Для проведения ПЦР необходимо 3-5 нг геномной ДНК. В этих условиях ДНК, содержащая 5% и более мутантных копий KRAS, дает положительный результат в тесте.

Материал для исследования

В качестве материала для анализа может использоваться ДНК опухолей, выделенная из свежей и свежезамороженной ткани или образцов фиксированной ткани, заключенной в парафин. Опухолевая ткань, из которой выделяется ДНК для анализа, должна содержать не менее 10% опухолевых клеток. Для анализа образцов ткани, заключенной в парафин, достаточно 2-4 среза толщиной 10 мкм. Пригодность ДНК для теста может сильно варьировать в зависимости от способа фиксации ткани и метода выделения ДНК. Мы рекомендуем набор для выделения ДНК из срезов тканей, залитых в парафиновые блоки.

Принцип действия набора

Анализ проводится методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Количество циклов ПЦР, необходимых для того, чтобы флуоресценция превысила уровень фона, называется Ct. ДНК KRAS дикого типа (без мутаций) амплифицируется в тех же условиях с увеличением Ct на 7-10 циклов, что позволяет отличать ее от мутантной. Величина Ct зависит от количества и качества ДНК вносимой в ПЦР. Для нормировки теста проводится контрольная ПЦР с праймерами на константный район гена KRAS. Таким образом, с каждым препаратом ДНК проводится 8 реакций: одна контрольная реакция и семь реакций соответствующих разным мутациям 12 и 13 кодонов. Результаты анализа представляются в виде разницы ΔCt = Ctмут - Ctконтр. Для корректности результата все образцы тестируются как минимум дважды.

Для контроля специфичности и чувствительности теста в набор входит положительный стандарт, содержащий 5% ДНК, в которой ген KRAS содержит мутацию. Положительный стандарт тестируется параллельно с неизвестными образцами. Образец является положительным (содержащим мутацию), если ΔCt образца равно или меньше ΔCt положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 5%), если ΔCt образца больше ΔCt стандарта.

Состав набора

• восемь ПЦР смесей без полимеразы для анализа 7 мутаций и 1 варианта без мутаций
• Taq ДНК полимераза
• положительный стандарт мутантной ДНК KRAS - смесь 7 фрагментов ДНК, содержащих мутации в гене KRAS
• контрольная ДНК человека без мутаций в гене KRAS
• вода для ПЦР
• руководство по применению

Набор не содержит реактивов для выделения ДНК.

Внимание! Использование Taq ДНК полимеразы из других источников может привести к появлению некорректных результатов анализа.

Условия хранения

6 месяцев при -20°С